研究背景
在诸多育种方法中，辐射诱变育种是一个重要的补充，越来越受到从业人员的重视，取得了很多有目共睹的实际成果(刘春泉等, 2007)。加强对辐射诱变后代遗传变异的研究，是探讨提高辐射诱变育种效率的重要保证(李奇等, 2011; 任莹, 2014)。目前，我国草莓辐射诱变的研究大多集中在植株上、集中在其生长水平上，对种子辐射诱变以及分子水平的研究鲜见报道(张慧琴等, 2007a; 2007b)。

分子标记是20世纪80年代初发展起来的遗传标记，特点是遗传方式简单、稳定，能够反映研究对象的个体及群体特征(陈琼娥等, 2011)。其中ISSR标记被认为适合于草莓遗传变异的研究，实验证明利用ISSR标记进行草莓亲缘关系是完全可行的，可作为鉴定草莓亲缘关系的参考依据(花秀凤, 2013)。

本研究利用ISSR标记来分析不同辐照剂量的对种子诱变的遗传多态性特点和多样性差异；经过辐照后，通过基因层面确定草莓种子其遗传变异状况，为相关突变体的筛选、利用提供一些参考，更快速有效的推动草莓的新品种选育及发展。

1结果与分析
1.1辐照群体的遗传多样性分析
筛选出的4条ISSR引物对3个辐照群体的19个样品进行扩增检测，共产生31个条带，其中具有多态性条带24条(表1)。3辐照群体的各遗传多样性指数(表2)表现出辐照群体3和2相对最大，1次之。从其他遗传多样性指数可以看出辐照群体具有较高的遗传多样性。

表1 ISSR引物序列及扩增 注: a: Y: T/C; b: R: A/GT able 1 Sequences of ISSR primers and their amplification Note: a: Y: T/C; b: R: A/G

表2 辐照群体遗传多样性分析 注: a: “±”后面的值为标准差 Table 2 Statistical analysis of irrigation population genetic diversity Note: a: Values behind with “±” are standard deviations

1.2辐照群体的遗传结构分析
辐照群体基因多样性的Nei分析揭示(表3)，辐照群体间基因多样度(Dst=Ht-Hs)为0.046 6，辐照群体间的分化指数(Gst)为0.214 0，表明总的遗传变异主要来自于居群内部，辐照群体内的遗传分化大于辐照群体间。分子方差变异分析(AMOVA)结果(表4)，也再次证实，总的遗传变异中有78.9%的变异存在于辐照群体内，0.5%发生在辐照群体间，20.6%发生在组间。

表3 辐照群体的遗传结构分析 Table 3 Nei’s analysis of genetic diversity of irrigation populations

表4 分子变异的AMOVA分析 注: Va: 组间变异组分; Vb: 辐照群体间变异组分; Vc: 辐照群体内变异组分。 Table 4 Analysis of molecular variance (AMOVA) within/among irrigation populations Note: Va: Varinance components among groups; Vb: Varinance components among irrigation populations; Vc: Varinance components within irrigation population

1.3遗传距离和聚类分析
通过(表5)可以看出经过辐照处理的3个辐照群体间遗传距离近，相似程度高，而对照群体与之相距较远，相似程度略低。从辐照群体关系聚类图(图1)中可看出，4个辐照群体聚为2支：一支包括了3个辐照处理辐照群体；另一支为对照群体，其中辐照剂量高的2个辐照群体先聚为一类，然后再与辐照群体1(辐照剂量低)相聚。4个辐照群体的聚类结果表现出了明显的特征。

表5 辐照群体的遗传相似系数(上三角)及遗传距离(下三角) Table 5 Nei’s genetic identity (Id) (above diagonal) and genetic distance (D) (below diagonal) of 5 populations

图1 UPGMA法构建的试验群体的聚类 Figure 1 Dendrogram of tested strawberry clustered using UPGMA

1.4单倍型分析
由62个样本共享19个单倍型，它们在各群体中的分布(表6)。根据遗传相似度通过UPGMA聚类(图2)，可知单倍型各单倍间相似性较高，属于同一处理群体的个体并不完全聚在一起，有一些的样本聚在离辐照群体较远的位置，这些样品表现了较高的遗传多样性，可作为育种材料。

表6 单倍型数量及在辐照群体中的分布 Table 6 Number and distribution of haplotypes in populations

图2 基于Nei遗传距离的19个单倍型的UPGMA聚类图 Figure 2 UPGMA dendrogram illustrating relationship of 19 haplotypes

对辐照处理的3个剂量辐照群体的研究，基于Shannon指数(I)平均值为0.358 1±0.250 6和Nei指数遗传多样性(He)平均值为0.232 6±0.177 7，表明处理后的辐照群体遗传多样性很高。相对而言，在遗传多样性上，剂量愈大，遗传多样性愈高。从各剂量包含的单倍型来看，中间剂量处理后出现的单倍型最好，相对来说，剂量愈大，单倍型愈多。遗传变异方面，总遗传多样性(Ht)为0.264 4，辐照群体内的基因多样性(Hs)为0.207 8，Nei指数显示的辐照群体间的遗传分化系数(Gst)为0.214 0，通过AMOVA分析显示21.1% 的遗传变异存在于辐照群体间，有78.9%存在于辐照群体内，0.5%发生在辐照群体间，20.6%发生在组间，这些结果都表明3个剂量处理后的辐照群体遗传变异主要来自辐照群体内，且组间也较大，说明这些遗传变异主要是由辐照引起的。Wright认为种群间基因流(Nm)大于1，则能发挥其均质化作用；反之若小于1，则表明基因流(Nm)成为遗传分化的主要原因(Wright, 1990)。辐照群体内的基因流为1.836，大于1，表明不同辐照处理后的辐照群体并没有出现明显的遗传分化。3个辐照处理后的辐照群体间遗传相似度高，而对照与它们的相似性程度较低。聚类结果2个高剂量辐照群体先聚合在一起，然后再和低剂量辐照群体相聚，最后与对照相聚。表明随着辐照剂量的增大，其处理后的辐照群体越远离对照辐照群体。另外，3个辐照处理后的辐照群体聚在一起，也表明其遗传关系很近，它们的遗传变异主要来源于辐照。从聚类图可看出，虽然辐照处理辐照群体先聚成一支再和对照辐照群体相聚，但辐照群体间遗传距离总体还是比较小的，说明这4个辐照群体其实总体还可以认为是一个辐照群体。

2.2种子辐照处理在草莓选育中的可行性
吴伟民等采用30~80 Gy剂量的γ射线辐照5个草莓品种的匍匐茎植株，对辐照结果进行了研究，结果表明，且各品种的死亡率均有随着剂量增加而提高的趋势(吴伟民等, 2007)。张慧琴等以丰香草莓的无根无菌苗为试材，研究了γ射线辐射对草莓叶片再生及植株继代增殖的影响。结果表明，其叶片对辐射敏感，半致死剂量为10～20 Gy (张慧琴等, 2007a)。张慧琴等以20~100 Gy射线辐照处理丰香试管苗辐射诱变育种试验。试验结果表明各处理对草莓植株的生长和发育均有影响，丰香半致死剂量约为55 Gy (张慧琴等, 2007b)。而本研究是对种子进行辐照，并对辐照后的种子进行发芽，未涉及其致死情况。

经分析可知，62个样本共得19个单倍型，其中有18个均为辐照后出现的，从它们在各辐照群体中的分布看，中高剂量辐照处理所获得的单倍型更多。各单倍型UPGMA聚类图，可以看出有很多的变异性比较大的单倍型存在，这些单倍型表现了较高的遗传多样性，选取这些具有较高遗传多样性的个体，对其进行后期性状的评价，再结合相关性状参数，最终将可以作为很好的育种材料。研究结果同时认为对种子进行辐照处理可以为草莓选育提供一个可操作的手段，可以作为草莓选育的前期筛选工具。

3材料与方法
3.1供试草莓品种材料
试验的研究材料是于阜阳市农科所提供的，种子经60 Gy、100 Gy和150 Gy，3个剂量的γ射线(60Co)。辐照处理后，进行培育，共选取60份(每个剂量20份)单株形成三个辐照群体，以其为试验材料，未处理丰香草莓单株2份为实验对照(表7)。草莓样品要进行处理，在摘取的两天前要对样品进行遮光,然后摘取草莓未展开的嫩叶，把采下的嫩叶装在样品袋中，做好标记后立即置于冰盒内，带回实验室，再用蒸馏水冲洗一遍，晾干后放在-20℃的冰箱中备用。

表7 草莓样本信息 Table 7 Samples of Strawberry used in this study

3.3 PCR扩增及引物筛选
最佳PCR反应体系优化：总体积20 μL，含10×PCR Buffer (含Mg2+) 2.0 μL、DNA模板(50 mg/μL) 1 μL、dNTP (2.5 μmol/L) 1.6 μL、引物(10 μmol/L) 1.2 μL、Taq DNA聚合酶(2.5 U/μL) 0.4 μL，加ddH2O 13.8 μL。扩增程序(安娜等, 2009; 陈大霞等, 2007)：94℃预变性5 min；94℃变性40 s，退火60 s (退火温度随引物而定)，72℃延伸1.5 min，共35个循环；最后72℃延伸7 min。PCR扩增在BIO-RAD T100TM Thermal Cycler PCR仪上完成。电泳条件：1.5%的琼脂糖凝胶上电泳(1.0×TAE，100V)分离，溴化乙啶(EB)染色显带(Mchandrika et al., 2010)。DNA片段通过凝胶成像系统(Alpha Innotech)观察记录。

3.4数据分析与处理
ISSR电泳图谱按Weising的方法将有条带或弱带记“1”、无条带记“0”，转化为0/1矩阵的二元数据计算多态性(Nie et al., 2012)。用POPGENE v1.32软件将处理好的图谱数据进行相关分析：计算多态位点百分率(PPB)、Nei’s基因多样性(He)、Shannon’s信息指数(I)、观测等位基因数(Na)、有效等位基因数(Ne)、居群总遗传多样性(Ht)、多态位点(Np)、居群内遗传多样性(Hs)、各居群间的遗传分化指数(Gst)、基因流(Nm)、和Nei’s遗传距离(D)。用软件Arlequin 3.l进行AMOVA分析，计算组间，辐照群体间及辐照群体内的遗传多样性。根据辐照群体及单倍型遗传距离，用软件NTSYS-pc version 2.1采用UPGMA进行聚类分析(Nie et al., 2012; 2014)。

作者贡献
聂传朋为本研究的论文执行者，负责数据整理与分析、论文撰写；杨盼盼负责做相关分子实验；李焰焰负责论文设计、指导及论文修改；马宗新负责样品的辐照处理。

致谢
本研究由安徽省高校自然科学重点项目(KJ2015A217)和阜阳师范学院科研项目(2015FSK- J15)共同资助。

参考文献
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